Hidroksimetilasyon

Genom capinda hidroksimetilasyon analizi icin iki ana platforma sahibiz.

Hidroksimetile kitaplik fragmentlerine yuksek duyarlik ve ozgulluk saglayan genom capinda 5hmC CapSeq protein bazli zenginlestirme teknigine (immunopresipitasyondan ziyade) dayanir. Bu zenginlesen kitapliklar daha sonra, hidroksimetile ‘’pik’’lerinin net gorunusleriyle ya da altinci bazi isaretlemek icin artan okuma yogunlugunun bolgeleriyle genom boyunca yogunluk okumalari verimliligi icin biyoinformatik takimimiz tarafindan sekanslanir ve islenir.

Alternatif zenginlestirme metodolojileriyle karsilastirildiginda, antikor bazli immunopresipitasyon ya da diger bioortogonal isaretleme gibi JBP zenginlestirme taslagi bircok avantaj saglar:

• JBP-1 peptidi tek bazli modifikasyonu taniyabilir ki orda ilgili bir fragmentin etkileyici bir sekilde asagi cekimi icin antikorlar baz kumelerine ihtiyac duyarlar.
• Immunopresipitasyon bircok DNA elementleri ve kromatin bolgelerine karsi yanilgi gosterir.
• Cogu antikorun zitti, JBP-1 peptidi daha kesin sonuclara izin vererek metil- ve hidroksimetil-sitozin arasinda sifir capraz konusmaya sahiptir.
• JBP-1 bazli protokollerimizin okuma degerleri alternatif bioortogonal etiketli metodlarla karsilastirildiginda arkaplanlari azaltir.

Ikincisi sadece burda, Zymo Research’te gelistirilen yeni bir metoddur. 5-hidroksimetilsitozinin (5-hmC) genom capinda, tek bolge haritalamasini sunan ilk servis saglayici oldugumuz icin gururluyuz!

Bu yeni, Reduced Representation Hydroximethylation Profiling (RRHP) unvani verilen metod, bir spesifik iplikcik olusumunda tek-bazli rezolusyonla 5-hmC isaretinin genom capinda haritalanmasina izin verir. HiSeq platformda sekanslama icin sadece 5-hmC isareti tasiyan fragmentleri secmek icin gelecek nesil kitapligi insaasi icin kullanilir ve fragmente edilir. RRHP’den datalar, kolay bir sekilde RRBS gibi metodlarin profillenmesinden urun ile, metilasyon datalarini kuvvetli karsilastirmalara izin vererek cift olur. Metod, oksidasyon ve deaminasyon gibi kimyasal konversiyon sureclerinden kacinir ve SNP belirleme ve analizi gibi genomik varyasyonla epigenetik modifikasyonlarin analizleriyle cift olabilir.

RRHP diger bir tek-bolge haritalanmasi tekniklerini iceren cok sayida avantaj saglar :

• Dusuk DNA girdilerinden (100ng) calisma yeterliligi
• Paralel eksiltici sekanlama icin ihtiyaci elemine eden guclu pozitif goruntuyu saglar.
• Sert kimyasal konversiyon yapmaz, daha yuksek komplexteki kitaliklara izin verir.
• Basit SNP belirleyiciler boyunca polimorfik degisimlerle epigenetik analizle cift yapabilme yetenegine sahiptir.
• Dusuk 5-hmC bollugunu belirlemek icin yuksek sekanslama derinligine ihtiyac duymaz.

RRHP bir genomik kitapliga bagli uyarlayicida restriksiyon dijesyonu inhibe etmek icin β-glucosyltransferase (β-GT)’dan faydalanir. Guclendirilecek ve sekanslanacak uyarlayici baglantilarda sadece fragmentlerin glukosile olmus 5-hmC artiklarinda mevcut oldugu gibi. Sistem adapterize olmus kitapliklari degerlendiren herhangi bir platform icin adapte edilebilir, ve fragmentasyon ve kitaplik digesyonu icin diger glukoz-duyarli restriksiyon enzimleri (GSREs) kullanarak, non-CpG iceriklerindeki gibi alternatif CpG motiflerinde 5-hmC bolgelerini profile edebiliriz. Nihai sonuc, kolay gorsellestirilen, tarayici parcalarin formlarinda yayinlanabilir data, fonksiyonel ve aciklamali genomik korelasyonlar, ciftli karsilastirmalar ve daha fazlasidir. Biz bu analizi, genom boyunca 5-hmC’yi profile edebilmek icin dayanikli bir arac olarak ve onun biyolojik onemi aciklamaya yardimci olucak ve daha ilerideki 5-hmC arastirmalarina kolaylik saglayacak olarak bulduk.

Tum platformlarin Temel Servis Paketleri, ornek standardizasyonu, kitaplik yapisi, NGS ve ham data siralamasi icerir. Full Servis Paketleri ek olarak down-stream biyoinformatik islemi ve ihtiyaclariniza ozel uygun hale getirilmis istatiksel analizi de sunar. Tum sekanslama Illumina HiSeq2000 uzerinde yapilir.