ChIP Hazırlama Kitleri
TEKNİK ÖZELLİKLER
ChIP (Chromatin Immunoprecipitation) transkripsiyon faktörleri veya histon proteinlerinin DNA ile etkileşimlerinin saptanması, bu etkileşimlerin gen aktivasyonu üzerindeki etkisinin araştırılması için kullanılan bir yöntemdir. Chromatin Immunoprecipitation temeli hücre veya dokunun formaldehit ile croslink yapılmasıyla kromatin proteinleri ile DNA bağlanır, sonrasında kromatin ekstrakte edilir ve enzim veya sonikasyonla DNA 200bp-1 kb aralıklarında fregmantlara ayrılır. Bu kromatin proteinleri üzerindeki modifikasyonlara veya kromatin proteinlerine özgü antikor ile immunoprecipitation işlemi yapılarak ilgilenilen kromatin fregmantları işaretlenir, Protein G agarose bead veya Magnetic Agarose beadler kullanılarak DNA-protein-antikor bileşimleri ayrıştırılır. Proteinase K ile ortamdaki proteinler uzaklaştırılır ve DNA fragmentleri End point PCR, Real Time PCR, ChIP-Seq, ChIP on ChIP (ChIP array) yöntemleri ile analiz edilir.
Active Motif ChIP hazırlama kitleri size hızlı, etkili, standardize edilmiş protokol ile en iyi sonucu verecektir.
ChIP-IT® Express Chromatin Immunoprecipitation Kits
magnetic beads make ChIP fast, easy & more reproducible
ChIP-IT® Express Kitleri protein-G-Agarose beadleri yerine protein G-coated magnetic beadleri kullanır. Bu beadler agarose beadlerden daha düşük backgrounda sahip olup, bloklama gerektirmez ve yıkama sayısı az ve yıkama adımları daha az zaman almaktadır. Yıkama daha kolaydır çünkü spin adımları yerine hızlı magnetic pull-down adımları vardır. Yıkama sayısının azalması DNA kayıplarını azaltmakta ve ürün verimliliğini arttırmaktadır. Magnetik beadler çok yüksek bağlama kapasitesine sahip olup çok az miktarda kullanımı yeterli olur böylece non-spesifik bağlanmalar azaltılır.
Kit içinde mevcut çalışma için gerekli optimize edilmiş bufferlar background’u azaltmaktadır. Azalan backround daha az hücre ile çalışabilme imkanı vermektedir.
Analiz öncesi DNA purifikasyon aşaması gerektirmez, böylelikle purifikasyondan kaynaklı olabilecek DNA kayıplarının önüne geçilir.
Kitler ile birlikte magnet-bar verilmektedir. Diğer ticari magnetic standlar ile de uyumludur.
Hızlı ve tekrar edilebilir protokol zaman ve efor tasarrufu sağlar.
Enzim veya sonikasyon kullanımı için kit seçenekleri mevcuttur. Başarılı ChIP yapmanın ilk adımı kromatini 200 bp-1000 bp arasında fragmentlere ayırmaktır. Sonikasyonu olmayan kullanıcılar enzimatik shering kiti tercih edebilirler.
ChIP işlemlerinin gerçekleştirilmesi için Protein G beadleri ve DNA nın minimal kaybını sağlayan 1,7 ml lik silikonize tüpler içerir.
Over-fixation durumunda kromatin shearinge karşı rezistans gösterebilmektedir, kit formaldehit hariç cell fixation için gerekli tüm bufferları içerir.
| Standard ChIP protocol | | ChIP-IT Express protocol |
| Prepare chromatin by sonication | | Prepare chromatin by sonication or enzymatic digestion |
| Block protein G beads, then use beads to pre-clear chromatin | | |
| Combine chromatin and antibody; incubate 4 hours or overnight | | Combine chromatin, antibody and magnetic beads; incubate 4 hours |
| Add blocked protein G beads and incubate 1.5 hours | | |
| Wash beads 8 times (each wash: pellet beads with a 2-minute centrifugation, let beads settle, remove supernatant, resuspend) | | Wash beads 3 times (each wash: pellet magnetic beads in seconds with magnet, remove supernatant, resuspend in wash buffer) |
| Elute chromatin from beads using two 15-minute elutions | | Elute chromatin (15 minutes), pellet beads in seconds with magnet and transfer supernatant to a fresh tube |
| Reverse cross links (4 hours at 65°C) | | Reverse cross links (15 minutes at 94°C) |
| Add Proteinase K to digest proteins (1.5 hours at 42°C) | | Add Proteinase K to digest proteins (1 hour at 37°C) |
| Purify DNA by 2 phenol/chloroform extractions, followed by precipitation and resuspension | | Add Proteinase K Stop Buffer |
| DNA is ready for analysis (e.g. PCR) | | DNA is ready for analysis (e.g. PCR) |
ChIP-IT® High Sensitivity
ChIP for limited sample material and low abundance target proteins
The ChIP-IT® High Sensitivity Kit diğer ChIP metodları ile sinyal oluşturmayan antikorlar ile kullanım için idealdir. Zaten düşük miktarda bulunan proteinlerin spesifik bağlanmalarını algılamak için sensitive bir metoddur. Bol miktarda bulunan hedeflerden ChIP başına en az 1000 hücreden yüksek kaliteli DNA zendinleştirilmesine izin vermek için dizayn edilmiştir. Kit transkripsiyon faktörleri veya bağlanma affinitesi düşük antikorlar gibi düşük miktardaki proteinlere karşı kullanılan antikorların chromatin immunoprecipitation işlemini yaparak mükemmel sonuçları verecek şekilde optimize edilmiştir.
ChIP-IT® High Sensitivity Avantajları
High sensitivite, high signal, düşük non-spesifik binding background
Az miktarda materyalle çalışma imkanı
Düşük affiniteye sahip antikorlar ile kullanılabilirlik
Düşük miktarlarda bulunan proteinlerden yüksek performansla DNA enrichment
ChIP DNA eldesi için her aşamayı içeren optimize edilmiş bufferlar
Kromatinin formaldehit ile fiksasyonu için özel dizayn fixation buffer
Yüksek verim ve kalitede kromatin eldesi
ChIP DNA purifikasyon kolon ve buffer içeriği
Düşük miktarda bulunan protein hedeflerinin algılanması
The ChIP-IT® High Sensitivity Kit diğer ChIP metodları ile sinyal oluşturmayan antikorlar ile kullanım için idealdir. Zaten düşük miktarda bulunan proteinlerin spesifik bağlanmalarını algılamak için sensitive bir metoddur.
Mükemmel Sensitivite Eldesi
Optimize edilmiş fixation, binding ve wash bufferleri ve özel olarak tasarlanmış Protein G Agarose beadleri birleşiminde daha yüksek signal ve daha düşük non-spesifik bağlanmaların eldesini sağlar. Reaktifler non-spesifik bağlanmaların oluşturduğu backgroung seviyelerini azaltır. Sensitivite artar ve en iyi enrichment elde edilir.
Az Miktarda Numune Kullanımı
ChIP-IT High Sensitivity Kit içindeki optimize edilmiş ChIP bufferları non-spesifik bağlanmaları azaltarak bunların background seviyelerini minimize eder. Azalan background yüksek miktarda bulunan proteinler için en az 1,000 hücreye kadar ve düşük miktarda bulunan proteinler için en az 50,000 hücreye kadar materyal ile çalışmayı mümkün kılar. Diğer ticari standart ChIP kitlerinin protokolleri optimum 1,5 milyon hücre ile çalışmak için dizayn edilmiştir.
Enriched DNA is ChIP-Seq Validedir
ChIP-IT High Sensitivity Kitten elde edilen yüksek kaliteli ChIP DNA, ChIP-Seq veya ChIP-chip downstream applikasyonlarda kullanılması için idealdir.
ChIP-IT® Express Sonication & Enzymatic Shearing Kits - Enzimatik veya sonikasyon ile çok hızlı ve kolay standart ChIP hazırlama kiti.
ChIP-IT® Express HT – Yüksek doğrulukta 96-well hızlı ChIP hazırlama kiti
ChIP-IT® High Sensitivity –Az miktardaki numuneler , düşük miktarda var olan transcription faktörleri, düşük affinity’e sahip antikor protokolleri için idealdir.
ChIP-IT® FFPE -Formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) numunesinden ChIP hazırlama kiti
ChIP-IT® PBMC-ChIP from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). PBMCs, including lymphocytes (T cells, B cells and NK cells), monocytes and dendritic cells
Re-ChIP-IT® – Aynı DNA fregmantı üzerine bağlanan 2 farklı protein için ChIP Kiti
Tag-ChIP-IT – Protein spesifik antibody kullanmadan ChIP hazırlama kiti
RNA ChIP-IT® – RNA ile ilgili ChIP hazırlama Kiti