EPİGENETİK NEDİR?

Epigenetik, DNA sekansını değiştirmeyip DNA, protein ve RNA’ların fonksiyonunun ve regulasyonunun değişimi ile sonuçlanan modifikasyonları  içerir. Embriyo sürecinden itibaren epigenetik patern  hücreye ve dokuya özgü olarak gelişmekte, hücre farklılaşması ve fenotipi oluşturmaktadır…






Epigenetik modifikasyonlar kalıtsaldır, gelecek nesillere taşınır, çevresel etkilerle değişir. Hücre bölünmesiyle epigenetik durum korunur.

Epigenetik durum çevre koşulları, beslenme, stres, kimyasal ve radyasyona maruz kalma, çeşitli hastalıklar gibi çevresel etkilerle değişir ve geri dönüşümlüdür.

Epigenetik modifikasyonları 3 ana başlıkta toplayabiliriz.

                                                                                      
1.      DNA Metilasyonu 

2.      Histon Modifikasyonları

3.      No-coding RNA’ların regülasyonu

      

     Epigenetik modifikasyonlar kromatin yapısını değiştirerek gen ekpresyonunu baskılayıcı veya aktive edici özellikler gösterirler.







DNA METİLASYONU                                             


   
   - CpG dinükleotidlerinde oluşur.


         - DNMT (DNA Metiltransferaz enzimleri) ile catalaz edilir.


  - Genom boyunca çoğunlukla metile, promoter bölgede veya ilk ekzonda gen ekpresyonuna müsaade etmek için unmetile (CpG adacıkları)                



DNA baz diziliminde  guaninden önce gelen sitozinin 5. karbonuna bir metil (CH3) grubunun bağlanması metilasyon olarak adlandırılmaktadır.


Tümör baskılayıcı genlerin promotor bölge metilasyonu ve onkogenler üzerindeki metilasyon kaybı kanser teşhis ve gelişim süresinde önemli ve tetikleyici rol oynamaktadır. Mutasyon öncesinde ortaya çıkan metilasyon kanserin erken teşhisi için önemli bir parametredir.

İstisnalar:

  • X kromozom inaktivasyonu
  • İmprite genler
  • Doku spesifik genler


Araştırma Alanları

       Kanser

       Gen Ekpresyonu

       Şizofren, bipolar bozukluklar, hafıza kaybı gibi nörolojik hastalıklar

       Kardiovascular Bozukluklar

       Infertility

       Yaşlanma

       Gen Imprinting

       Embriyoloji

       Cellular Differentiation and Stem Cell Research


       Infeksiyon disease



















DNA METİLASYONU VE GEN EKPRESYONU

Metillenmiş DNA Gen Ekspresyonunu 2 yolla etkiler.

  1. Transkiripsiyonel faktörlerin DNA’ya bağlanmasını engelleyerek direk etkiler. 
  1. MBP (Methly CpG Binding protein) proteinlerini toplayarak indirek etkiler.
              (Örneğin RNA polimerazı uzaklaştıran proteinler ve HDAC)


DNA METİLASYONU VE KANSER











Kanser kontrolsüz hücre bölünmesidir.

Kanser hücresinde DNA metilasyon paternleri değişir.

 - Global DNA hipometilasyonu

Promotor bölge hipermetilasyonu 

       Proto-onkogenler 

 Hücre çoğalmasını indükte edici genler

       Tumor Supressor Genler

       - DNA tamir mekanizması genleri, Hücre çoğalmasını denetleyen genler, apoptoz mekanizmaları   

GLOBAL DNA HİPOMETİLASYONU

 Kanser hücreleri normal hücrelere kıyasla global olarak azalmış metilasyon seviyeleri sahipler.

Satelite DNA, sentromerik bölge, CpG zayıf promotor, gene body bölgelerindeki CpG lerde global DNA metilasyon  kaybı ile; 

       Kromozal insabilite

       Transpozon aktivitesi

       İmriting kaybı (örnek; IGF-2 geni impriting kaybı neticesinde kolon, akciğer, karaciğer, over kanserleri ve Wilms’ tümörü)

       İnactive doku spesifik genlerin aktivasyonu

       Proto-onkogenlerin aktivasyonu

              Hücreyi kansere götürür.

  - Global hipometilasyon birçok insan tümörü tipinde DNA metiltransferase (DNMT) aktivitesini arttırır. Bu artış malignant hücrelerin çoğalma oranı ile ilgili olabilmektedir.


TÜMÖR SUPRESSÖR GEN HİPERMETİLASYONU

  • Kanser hücrelerinde Tümör supressor genlerinin promotor bölge CpG island metillenmesi neticesinde yüzlerce TSG susar ve kontrolsüz hücre bölünmesi engellenemez, hücre kanserogeneze girer.

  • Mutasyonla susan TSG diğer aleli metilasyonla susar, kanser gelişir. (Çift vuruş hipotezi)

  • Tümörün tipine göre hipermetile olan TSG sayısı ve metilasyon oranı değişir. RASSF1A ve p16 gibi bazı TSG genleri çoğu kanserde ortak olarak metiledir. Diğer genler kanser türüne göre metile olur. Örneğin GSTP1 geni prostat kanserlerinde %90 metile iken acute myleoid leukemia da çoğunlukla unmetiledir.

  • Genetik mutasyonlardan daha fazla görülür.

  • Tümör gelişiminin erken evrelerinde görülebilir.

  • Her kanser hastası farklı etkilenir.

KANSER TERAPİSİ

       Histon Deasetilaz (HDAC) Inhibitörleri

       DNA Metiltransferase(DNMT) Inhibitörleri

  ile susan Tumor Supressor Genlerin yeniden aktivasyonu amaçlanmaktadır.

DNA Metilasyonu Ölçüm Teknikleri

 

            a)      Methylation-sensitive restriction enzymes

       Southern-blot hybridization

b)      Bisulfite conversion of DNA

       Sequencing

       Methylation-specific PCR (MSP)

       Real-time MSP

       COBRA

       Pyrosequencing

       MassARRAY

       MeDIP

 

DNA Metilasyonu ölçümü için günümüzde birçok yöntem kullanılmaktadır. Geliştirilen sistemlerle gen bölgesi bazında ve bütün bir genomun metilasyon statüsünü ölçmek mümkündür.



Çoğu metilasyon ölçüm tekniği sodium bisülfit treatment yöntemiyle bisülfit modifikasyonu yapılmış DNA numunesini kullanmaktadır.















DNA BİSÜLFİT MODİFİKASYONU

Metilasyon ölçümü için bisülfit modifikasyonu yöntemi gold standart olarak kabul edilmektedir.  Bu yöntemde DNA baz diziliminde metillenmemiş olan tüm sitozin bazları kimyasal reaksiyonla urasil’e dönüştürülür. Metile olan sitozinler etkilenmez, sitozin olarak kalır.

Bisülfit modifikasyonu yapılan DNA end-point PCR, RT-PCR, sekans, Cobra, ChIP, mikroarray gibi yöntemlerde kullanılır.

 

DNA Bisülfit modifikasyon kitleri ile DNA nın bisülfit conversiyonu %%99,0 - 99,5 conversiyon etkinliği ile 1,5-3,5  saatte gerçekleştirilir, bisülfit atıklarından arındırılmış purifie DNA elde edilir.

 

Region-Specific DNA Methylation Analysis kitleri ile herhangi bir gen bölgesinde bisülfit modifikasyonu yapmadan RT-PCR ile metilasyon yüzdesi quantitative olarak elde edilir.

 

5mc Elisa kiti ile DNA nın global metilasyon yüzdesi ölçülür.

 

Zymotaq polymerase MSP PCR için eşsiz metilasyon spesifik TAQ polimerase enzimidir. GC yönünden zengin,  bisülfit modifikasyonu yapılmış DNA yı amplifie özelliği var ve hotstart. Enzim DNT miks de içermektedir



HİSTON MODİFİKASYONLARI

Histon Modifikasyonları Histonlarda meydana gelen acetylation, methylation, phosphorylation, ubiquitination ve sumoylation gibi modifikasyonlar kromatin yapısını değiştirerek gen anlatımını regüle eden epigenetik mekanizmalardandır. En iyi karakterize edilen histon modifikasyonları asetilasyon ve metilasyon’ dur.

 

Histon Asetilasyonu Histon proteinlerinin N-terminal tırnaklarının lysine(K) resudelerinde oluşur. Nükleozom yapısını gevşeterek transkripsiyon faktörlerinin DNA’ya ulaşmasını sağlar, aktif gen anlatımına neden olur. Histon acetlytransferases(HAT) ve Histon Deacetlylases(HDAC) histonlara asetil gruplarının eklenmesi ve çıkarılmasını katalaz eden enzimlerdir.

 

Histon Metilasyonu Histon proteinlerinin N-terminal tırnaklarının lysine(K) ve arginine(R) resudelerinde tekli, double veya trible olarak oluşur. Ortaya çıktığı yere göre transkripsiyonel aktivite veya baskılamaya neden olur. Histon methyltransferase (HMT) ve histon demethylase (HDM) enzimleri ile regüle edilir.

 


Histon Acetylation



Histon Methylation



Phosphorylation

 

Ubiquitination


Sumoylation



KROMATİN YAPISI


















  • Kromatin nükleozom denilen ve birbirini tekrar eden DNA, protein ve RNA dan oluşan kromozom yapı birimidir.
  • Her nukleozom H2A, H2B, H3 ve H4 histon proteinlerinin her birinden 2 şer adet içerir. Bu komplekse histon core octomer denir.
  • Her nukleozom içinde 147 baz DNA bir histon core octomer etrafında sarılarak paketlenir.
  • Herbir nükleozom 10-60 bp lik DNA parçaları ile birbirinden ayrılmıştır.
  • Histonlarda oluşan epigenetik modifikasyonlar, kromatin yapısını kapatıp sıkılaştırarak veya açıp genişleterek gen ekspresyonunu baskılar veya aktive eder.
  • İfadesi baskılanan genler heterochromatin yapısı içinde, aktif ifade edilen genler euchromatin yapısı içinde bulunur.