ChIP Nedir?

ChIP (Chromatin Immunoprecipitation) transkripsiyon faktörleri veya histon proteinlerinin DNA ile etkileşimlerinin saptanması, bu etkileşimlerin gen aktivasyonu üzerindeki etkisinin araştırılması için kullanılan bir yöntemdir. Chromatin Immunoprecipitation temeli hücre veya dokunun formaldehit ile croslink yapılmasıyla kromatin proteinleri ile DNA bağlanır, sonrasında kromatin ekstrakte edilir ve enzim veya sonikasyonla DNA 200bp-1 kb aralıklarında fregmantlara ayrılır. Bu kromatin proteinleri üzerindeki modifikasyonlara veya kromatin proteinlerine özgü antikor ile immunoprecipitation işlemi yapılarak ilgilenilen kromatin fregmantları işaretlenir, Protein G agarose bead veya Magnetic Agarose beadler kullanılarak DNA-protein-antikor bileşimleri ayrıştırılır. Proteinase K ile ortamdaki proteinler uzaklaştırılır ve DNA fragmentleri  End point PCR, Real Time PCR, ChIP-Seq, ChIP on ChIP (ChIP array) yöntemleri ile analiz edilir.

 

ChIP hücrede genlerin nasıl düzenlendiğini anlamak, Histon kodunu çözmek ve belirli haldeki kromatinleri bireysel locilere bağlamak için kullanılır. Chromatin IP ilk olarak 1993 yılında, mayadaki histon asetilasyon durumunun transkripsiyonel gen susturulması ile bağlantısını çalışan, James Broach grubu tarafından bashedilmiştir. Bu teknik, 1998 yılında Richard Treisman’ın grubu tarafından memeli hücreleri üzerinde başarıyla uygılanmış ve yayınlanmıştır. ChIP’in temeli, hücrelere protein uygulanarak DNA’dan kromatin proteinlerini düzenlemek, daha sonra kromatin elde etmek, elde edilen ürünü çalışabilir parçalara ayırmak ve onu kromatin proteinlere özgü antikorlarla veya bu kromatin proteinlerinin değişimleriyle zenginleştirmek temeline dayanır. Başlangıçta, elde edilen kromatin, ilgili locinin nitroselüloz ve işaretlenmiş tamamlayıcı DNA’nın poblanması ile hareketsizleştirilmesi yöntemiyle analiz ediliyordu. Bu işlem, PCR sonuçlarının çabuk elde edilmesi için, teknik hassasiyeti çok kısıtlayıcıdır. İlk başta, yükseltilmiş parçaları görüntülemek için, bitiş noktası PCR deneyleri ve jel elektroforez oluşuyordu. Son nokta PCR döngülerindeki, hedef sıralarının üstel amplifikasyonlarının dar bir aralık içerisindeki PCR döngülerinde oluşma eğilimi olması, verimsizlik yaratırki bu da kısıtlayıcı bir etkendir. Bitiş PCR’ı, hangi döngü sayısının en iyi amplifikasyon ile sonuçlandığını veremez. Gerçek zamanlı PCR, Kromatin Immunoprecipitation ile elde edilmiş locus özgü DNA miktarını ölçmek ve arka plan eşiğini geçmek için gerekli olan sinyalin devir sayısını belirlemeye yönelik daha iyi bir metottur. Bu, Ct değeri olarak adlandırılır ve eşiği geçen döngü sayısı olarak ifade edilir. Kullanıcı hala doğru sıranın çoğaltıldığını, o parçayı görüntülemek için, çoğunlukla jel elektroforez kullanarak, onaylamalıdır. Gen spesifik kromatin immunoprecipitation için, gerçek zamanlı qPCR, en geniş kullanılan ve güvenilen yöntemdir. İleri gelişmeler, elde edilen DNA’nın microarrayler ile problanması, hatta bazen tüm genomun çoğaltılmasıyla hassasiyetin arttırılması ile ilgilidir. Sonuç olarak, ChIP DNA tespiti için en yeni ve potansiyel olarak en güçlü tespit yöntemi, ChIP Seq. adı verilen doğrudan sıralama yapılan DNA yöntemidir. ChIP Seq.kullanılırken, göz önünde bulundurulması gereken en önemli nokta, bu DNA dizileri sıralama reaksiyonlarını kirleteceği için, protein G boncuklarını engelleyen, memeli olmayan DNA’yı kullanan eski Chromatin ChIP kitlerinden uzak tutmaktır. Active Motif ChIP-IT Express kitleri, kullanıcıların ChIP-Seq için, ChIP reaksiyonlarını Next Generation Sequencing platformuna geçişleri için uygundur.

 

Epigenetik Çalışmalarında Chromotin IP’nin Merkezi Rolü

ChIP, genom içerisindeki bireysel locilerdeki genetik işaretleri tespit etmek için kullanılan temel bir tekniktir. Epigenetik araştırmacılar için, Histon işaretleri ve gen ekspresyonu arasındaki veya histon olmayan protein bağlanması ilişkilerini tespit etmek, transkripsiyon faktörleri, kromatinler ve onların gen ekspresyonuna olan etkilerini belirlemek, hangi locinin spesifik immunoprecipitation ile zengileşmiş halde olduğunu bulma çalışmalarında, ChIP gereklidir. ChIP, çok sayıda faktöre bağlı olarak başarısızlıkla sonuçlanabilecek, teknik olarak oldukça zor bir yöntemdir.

Active Motif’in, optimize edilmiş reaktifleri ve protokolleriyle, geliştirilmiş ChIP-IT Kitleri, piyasadaki en hassas ChIP kitlerinin temin edilebilmesi haline gelmiştir. ChIP-IT Express Kitleri, gerekli olan bütün kritik bileşenleri tek bir ChIP kiti içinde hazır halde olmasını sağlayarak ve bunun ChIP’te çalışmasını doğrulayarak, bu deney sürecini daha hızlı ve istikrarlı kılmıştır. ChIP-IT Express Kitleri, geleneksel kromation IP yöntemi üzerinden belirgin bir gelişmedir çünkü protein-G kaplı manyetik boncuklar kullanarak, sadece 1 günde ChIP gerçekleştirmeyi mümkün kılar. Ancak, transkripsiyon faktörleri gibi en düşük zenginlikteki proteinlerin en yüksek hassasiyetle algılanmasına ulaşmak isteyen araştırmacılar için, Active Motif’in ChIP-IT High Sensitivity Kit’i en iyi çözümdür. Düşük yoğunluklu proteinler ve düşük bağlanma eğilimine sahip olan ChIP antikorları çalışmalarına ek olarak, reaksiyonlar başına 1000 hücreden az hücre kullanılan sınırlı örneklerdeki ChIP reaksiyonlarını başarıyla gerçekleştirmek için, ChIP-IT High Sensitivity Kit kullanıma idealdir.

 

Activ Motif ChIP-IT  Önemli Avantajları

Protein-G ile birleştirilmiş manyetik boncuklarla birlikte temin edilen ChIP-IT Express kitleriyle, ChIP’teki verimliliğin artışı sayesinde, ChIP’in yarar alanını genişleten yeni kitler geliştirilmesini mümkün kılmıştır. Bu yeni kitler; aynı anda 96 kromatin-immunoprecipitation reaksiyonu işlenmesini gerçekleştiren ilk kit olan; ChIP-IT Express HT, sıralı ChIP yapan ilk kit olan; Re-ChIP-IT, epigenetik işlemlerde kodlanmayan RNA katılımını çalışabilme özelliğine sahip ilk set; RNA ChIP-IT, parafin kaplı doku örneklerinde DNA- protein etkileşimini araştıran ilk kit olan; ChIP-IT FFPE ve en son olarak PBMC’lerden kromatin çıkarımının yapılmasını gerçekleştirebilen ChIP-IT PBMC’yi, kapsar.

İster histonları, histon modifikasyonlarını, transkripsiyon faktörlerini ister kromatin ilişkili proteinleri inceleyin, ChIP-IT & ChIP-IT Express kromatin immunoprecipitation kits, sizin deneysel hedeflerinize ulaşmanıza yardımcı olacaklardır.